非線性成像技術是一種行之有效的工具，其通過提供獨特的數據來幫助生物學家將特定的分子活動與(yu) 細胞乃至整個(ge) 生物體(ti) 的功能和結構緊密聯係起來。目前有兩(liang) 大主要發展趨勢影響著可調諧超快激光器的設計，以實現在衍射極限或近衍射極限情況下的非線性顯微成像：第一是需要更長的波長來實現更深度的成像和更少的光損傷(shang) ；第二是使用更加靈活的係統來支持多模式成像。同時，係統靈活性不但能減少實驗的建立時間，而且還能令激光器的價(jia) 值最大化。

　　更寬的調諧範圍和更長的激發波長

　　非線性成像能夠受益於(yu) 超快激光光源更寬的調諧範圍，尤其是在長波長區域。更寬的調諧範圍能夠支持熒光體(ti) -染料、指示劑和熒光蛋白的樣品需求，這些樣品在尖端生物學領域的應用不斷增加。此外，對於(yu) 二次諧波和三次諧波成像而言，更寬的調諧範圍能夠使這些成像技術工作在一個(ge) 更加合適的波段，而這一波段正好能夠與(yu) 其他實驗參數和限製相匹配。最為(wei) 重要的是，擴展超快顯微鏡激光器的調諧範圍到更長波長，使得對更深層次組織的成像成為(wei) 可能（見圖1）。

　　圖1：更長的波長實現更深層次的組織成像。圖中小鼠腦部毛細血管的MPE照片，是利用AlexaFluor568和相幹公司的ChameleonVisionII激光器實現的雙光子激發成像。

　    之所以能夠在更深層次的組織中成像，是因為(wei) 生物樣品的光散射大部分是米氏散射，正比於(yu) 1/λ4。因此，即使激發波長有一個(ge) 很小的增加（如幾十個(ge) 納米），也會(hui) 導致散射部分極大的減少，這已被證明是在深組織成像中限製信噪比的一個(ge) 重要因素。

　　使用更長波長同樣能減少光損傷(shang) 。例如，曾有研究人員證實，在大多數植物標本上通過緊聚焦，可以使用平均輸出功率超過100mW的1280nm激光束安全地觀察到持續的多光子光譜。在同一項研究中，研究人員還發現當使用波長830nm、平均功率大於(yu) 10mW的鈦寶石激光束緊聚焦照射樣品時，通常在一秒鍾之內(nei) 就會(hui) 觀察到由多光子吸收激發引起的破壞性等離子體(ti) 的形成。在一項胚胎研究中[2]，研究人員指出：“很明顯，使用800nm和1250nm高強度光激發有顯著的不同。較長波長對胚胎的損傷(shang) 更小，可以認為(wei) 是安全輻射。”因此，較長波長同樣實現了高功率激光的安全使用，這反過來又促進了最大可能的成像深度。

　　靈活的波長調諧實現多模式成像

　　目前有各種各樣的非線性激發技術，每一種都適於(yu) 對不同種類的生物分子和微結構進行成像。例如，相幹反斯托克斯拉曼散射（CARS）通常是通過在2840cm-1附近激發它們(men) 的CH延展振動、從(cong) 而為(wei) 脂類成像提供最佳方法。另一方麵，多光子激發（MPE）是用於(yu) 激發熒光蛋白、傳(chuan) 統染色劑和內(nei) 源性熒光樣品熒光的理想方式。而二次諧波和三次諧波技術最適用於(yu) 膜、膠原蛋白和肌纖維，同樣也能用於(yu) 一些脂類。因此，研究人員經常想在同一個(ge) 樣品上同時使用這幾種不同的方法（見圖2），或者利用兩(liang) 個(ge) 不同波長進行多光子激發（MPE）。這被稱作多模式成像，理想的激發光源需要有兩(liang) 個(ge) 獨立可調諧的輸出波長。#p#分頁標題#e#

　　圖2：多模式成像案例--偽(wei) 彩色果蠅幼蟲全身成像。紅色是無標記CARS信號，綠色是雙光子熒光信號。

滿足顯微鏡成像的需求

　　為(wei) 了滿足長波長激發的需求，首先要擴展自動鈦寶石激光器的調諧範圍。具體(ti) 來說，當輸出波長超過1000nm時，鈦寶石的增益便會(hui) 逐步下降。然而，調諧範圍是可以通過減少損耗和增加泵浦功率來擴展的。例如，相幹公司最新的ChameleonVision係列激光器使用的寬帶光學元件具有極低的散射和吸收，配合使用相幹公司獨特的18W、532nm泵浦激光器，實現了波長範圍680~1080nm的一鍵式調諧。

　　隨著緊湊型光學參量振蕩器的不斷發展，如相幹公司的ChameleonCompactOPO，人們(men) 對使用波長大於(yu) 1080nm激光的興(xing) 趣也在不斷增加。通過使用集成式控製器即可輕鬆將波長調諧至1600nm，操作非常簡便。此外，使用可選的fan-poledOPO晶體(ti) ，可以讓鈦寶石激光器和OPO在不改變光束指向的條件下實現獨立調諧，這對於(yu) 多模式成像是非常理想的。現在又增加了一個(ge) 將OPO輸出倍頻得到可見光的選項，進一步增加了多模式成像的選擇（見圖3）。

　　圖3：Fan-poled晶體(ti) 的使用，使得鈦寶石振蕩器與(yu) OPO能夠實現獨立的大範圍波長調諧。OPO的輸出倍頻進一步擴展了多模式成像能力。圖中顯示了熒光體(ti) 與(yu) 成像技術是如何通過多模式成像來相互匹配的。藍色線條代表了頻率間隔為(wei) 2840cm-1的脂類CARS成像。

　　非線性或多光子成像是超快激光器的重要應用之一。激光器製造商正在從(cong) 操作的簡便性、調諧範圍和係統靈活性這幾個(ge) 方麵不斷改進超快激光器產(chan) 品，進一步支持該領域的發展。