2. 顯微鏡成像光路係統的調整及顯微鏡檢術概要　顯微鏡成像光路係統的調整，是根據不同顯微鏡檢術的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術與(yu) 方法。以下簡述顯微鏡檢術中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路係統的調整方法。

 　　(1) 透射光明視野（brightfield）　這是自顯微鏡發明以來最傳(chuan) 統、最普遍的應用方法。 
基本部件：

　　a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；

　　b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。

　　調整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明係統調整好後，即可應用明視野法。

　　適用範圍：所有已染色的組織切片、血液塗片等。

　　注意事項：

　　a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明係統調整好；

 　　b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中；

　　c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調節視野的亮度，更不要亂(luan) 調聚光鏡的高低位置，否則，會(hui) 降低顯微鏡的分辨率和破壞已調整好的庫勒照明係統；

　　d. 作顯微照相時，每換用一個(ge) 倍數的物鏡，就要調節聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等於(yu) 所用物鏡數值孔徑的2/3 。

　　(2) 透射光相差法（phase-contrast）　這是現代顯微鏡檢術中的一種反差增強法。

　　基本部件：相差物鏡、明視野與(yu) 相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。

　　調整方法：

 　　a. 在庫勒照明係統調整好的基礎上，用明視野方法把樣品調焦清晰；

　　b. 把聚光鏡轉到Ph1對準轉盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品；

　　c. 拔掉其中一個(ge) 目鏡，換上對中望遠鏡，並調焦於(yu) 視野中的兩(liang) 個(ge) 相差環上（物鏡的黑色相差環和聚光鏡的透光相差環）；#p#分頁標題#e#

　　d. 視野中的兩(liang) 個(ge) 相差環不一定重合，調節聚光鏡上的兩(liang) 個(ge) 調節裝置（調整相差環左右位置的調節杆和調整前後位置的摩擦式轉鈕），使透光環作前後左右移動而與(yu) 黑環重合；

　　e. 調整好後，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像；

　　f. 有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應設在Ph2位置上，用100物鏡時，聚光鏡應設在Ph3位置上。

　　適用範圍：適用於(yu) 觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

　　(3) 微分幹涉相襯法（differential interference-contrast，DIC）　為(wei) 了克服相差法觀察時樣品細節像周圍伴隨有光暈，會(hui) 掩沒掉本來應該看見的細節，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚於(yu) 10?m等局限性，利用雙光束幹涉的原理設計子微分幹涉相襯法。

　　調整方法：

　　a. 必須在庫勒明係統已調好的基礎上才能調好DIC方法；

　　b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調焦位置；

　　c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應為(wei) 東(dong) —西方向；

　　d. 把聚光鏡轉盤轉到與(yu) 10×物鏡對應使用的位置上，即DIC 0.3—0.4；

　　e. 在物鏡後方或物鏡轉換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）；

　　f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應為(wei) 南—北方；

　　g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調焦清晰； 　

　　h. 調節DIC插片，使微分幹涉相襯的像達到最佳效果，也就是浮雕效果最為(wei) 明顯；

　　i. 同時可調節聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達到最佳；

　　j. 然後再細微調樣品的細節，可見樣品中不同層麵上的結構；

　　k. 如果把補色器（first order red retardation plate）插入，並同時調節DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗(li) 色彩，紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用範圍：透明或不能#p#分頁標題#e# 
染色的組織切片，厚度可達100?m左右，培養(yang) 中的活組織和活細胞、小生生物等。

　　(4) 落射光激發的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）　簡稱為(wei) 落射熒光法，是近代顯微鏡檢術中新發展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經反光鏡射入物鏡去激發樣品，從(cong) 樣品上被激發的熒光經物鏡成像並穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。

        熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發樣品，隻要樣品中含有可產(chan) 生熒光的成分，它便吸收短波的激發光而釋放出波長較長的熒光。不同物質隻能吸改特定波長的激發光，而釋放的熒光也會(hui) 有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體(ti) ，受紫外光激發後能發出它們(men) 特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質吸收激發光後放出特有熒光的方法稱為(wei) 自發熒光法。某些物質自身不會(hui) 吸收激發光，或吸收後不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也隻能吸收特定的激發光，再釋放出特定的熒光，從(cong) 而間接地鑒別出某種物質，這稱為(wei) 間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用於(yu) 醫學、生物學及工業(ye) 的特異性研究和鑒別上。

　　調整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調整的方法大致相同。

　　① 汞燈的安裝

　　a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正麵，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側(ce) 或右側(ce) ；

 　　b. 把汞燈的上電極引張安裝並固定在散熱帽底麵的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中並固定；

　　c. 鎖緊散熱片上的螺絲(si) 後，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應的螺絲(si) ，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源後部專(zhuan) 用的插座上；

　　d. 詳細的安裝方法請參照有關(guan) 說明書(shu) 。

　　② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調整：

　　a. 接通汞燈電源，讓汞燈預熱10-15min；

　　b. 把汞燈燈室擺放在桌麵上，讓汞弧投影到2-3m外的牆上，劃一條與(yu) 燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為(wei) 參考線；

　　c. 轉動燈室調焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影於(yu) 牆上；

　　d. 分別調節燈室外殼上的5個(ge) 調節螺絲(si) 孔，把汞弧的像其反射像調成並排且盡量靠近，但不要重疊在一起。

　　③ 汞燈汞弧在顯微鏡內(nei) 位置的檢驗：#p#分頁標題#e#

　　a. 將汞燈照明光路係統中的視場光闌開到最大；

　　b. 把熒光濾光片組推到藍光激發的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼；

　　c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物台上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；

　　d. 取下一個(ge) 物鏡，使激發的藍光經物鏡轉換器的空檔照在白紙上，白紙上會(hui) 有一藍色的圓形照明區域，汞弧的像及其反射像都應該出現在這區域的中央部位，否則，可調節燈室調焦旋鈕至最清晰，然後分別調節燈室外殼上的5個(ge) 調節螺絲(si) 孔，直至汞弧的像及其反射像並排在照明區域的中央位置；

 　　e. 調好之後，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發後發射出的黃綠色熒光；

　　f. 仔細調焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細節隱約可見而很容易調焦清晰。

　　④ 汞燈使用注意事項　目前通常使用的為(wei) 50W超高氣壓汞燈，燈管內(nei) 通有一對鎢電極和液態汞（室溫下附在管壁上），未點燃時，管內(nei) 氣壓很低，在燈管的兩(liang) 電極間施加電壓角發點燃後，汞氣化為(wei) 汞蒸氣形成汞弧而產(chan) 生強光，溫度升高，管內(nei) 氣壓迅速升到10個(ge) 大氣壓。由於(yu) 是高氣壓的氣體(ti) 放電，必須了解其特性才能安全地使 用汞燈。

　　a. 汞燈接通電源後需要10-15min預熱時間，汞才能充分汽化並形成汞弧，產(chan) 生高亮度而穩定的激發光。因此，觀察前要提早通電；

　　b. 汞燈在使用過程中，不要隨意開關(guan) 汞燈的電源；

　　c. 關(guan) 掉汞燈電源後，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻後才可再次接通電源，違反這一操作規定時，將會(hui) 造成嚴(yan) 重後果。由於(yu) 汞燈內(nei) 的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nei) 阻很小，一旦通電在兩(liang) 電極間施加電壓，汞燈內(nei) 形成強大的電流，輕則燒斷保險絲(si) 或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個(ge) 實驗室，造成工作人員中毒，不僅(jin) 損失了汞燈，還會(hui) 炸毀燈室內(nei) 的集光-聚光部件；

　　d. 汞燈的使用壽命一般隻有300h，使用得當可達600h，使用壽命與(yu) 開關(guan) 的次數成反比，應集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價(jia) 格及昂貴，應珍惜使用；

 　　e. 汞燈壽命終結的標誌是點燃困難，燈管發黑。

　　5. 暗視野法（dark field）　許多透明或半透明的樣品，如細菌、微生物、細胞內(nei) 的精細結構及結晶體(ti) 的內(nei) 含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發亮的樣品輪廓及其細節。

　　普遍光學顯微鏡的最高分辨率為(wei) 0.2?m，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節構造分辨不清楚，但卻可看到0.004?m以上微細顆粒的存在，即可以看到亞(ya) 顯微結構，特別適合用來觀察微細的顆粒與(yu) 細菌等。

　　調整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明係統調整好。換上暗視野聚光鏡時，要把載玻片（樣品）移開，將浸沒油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物台上，浸沒油便充填在兩(liang) 者之間，這種聚光鏡須與(yu) 裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率幹式暗視野聚光鏡可與(yu) 中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光隻能透過光檔與(yu) 聚光鏡邊緣之間的透光環才能進入聚光鏡內(nei) 。#p#分頁標題#e#

　　對於(yu) 配備齊全的相差顯微鏡，與(yu) 編號為(wei) Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環，可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。

　　光學顯微鏡的保養(yang)     
 
　　顯微鏡是一種精密的光學儀(yi) 器，價(jia) 格普遍較高。從(cong) 結構上看，顯微鏡由許多光學部件和較精密的金屬零件組成，在使用過程中應特別注意做好保養(yang) 工作。

　　1. 嚴(yan) 格按照有關(guan) 操作規則使用顯微鏡，避免因使用不當造成損毀。

　　2. 顯微鏡在儲(chu) 存和使用過程中，普遍存在著生黴起霧問題，黴和霧會(hui) 使顯微鏡的視場模糊，分辯率下降。為(wei) 了使顯微鏡保持良好的工作狀態，延長使用壽命，顯微鏡的工作環境應保持清潔、幹燥、防塵。

　　3. 顯微鏡在每次使用完畢後應及時做好清潔工作，特別是目鏡、物鏡等容易汙染的光學部件，如發現表現表麵有灰塵、指紋、髒物等，應及時用鏡頭紙清潔幹淨。

　　4. 顯微鏡工作室最好能安裝空調、抽濕及防塵裝置。

　　5. 如發現光學部件內(nei) 部有生黴等現象，最好及時聯係有關(guan) 廠家派人清潔、維修。