激光掃描共焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM)是上世紀80年代開始投進實際應用的一種顯微設備。與(yu) 普通光學顯微鏡相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，並可以對觀測樣品進行分層掃描，實現樣品的三維重建和丈量分析;與(yu) 電子顯微鏡相比，LSCM可以在亞(ya) 細胞水平上觀察諸如Ca2 、pH值和膜電位等生理信號及活細胞形態的實時動態變化。因此，這項產(chan) 品的麵世是顯微成像技術發展史中具有劃時代意義(yi) 的重大進展。LSCM在形態學、分子細胞生物學、神經學、藥理學、遺傳(chuan) 學等生物醫學領域，以及材料學、地質學、水利學等產(chan) 業(ye) 工程領域有著廣泛的應用。根據應用方向的不同，可分為(wei) 生物用激光掃描共焦顯微鏡和產(chan) 業(ye) 用激光掃描共焦顯微鏡。
　　
　　一.LSCM的基本原理及結構特點
　　
　　普通光學顯微鏡使用的鹵素燈光源為(wei) 混合光，光譜範圍寬，成像時樣品上每個(ge) 照光點均會(hui) 受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的幹擾，影響成像質量。而LSCM結構上采用精密共焦空間濾波，形成物象共軛的獨特設計，激光經物鏡焦平麵上針孔形成點光源對樣品掃描，於(yu) 丈量透鏡焦平麵的探測針孔處經空間濾波後，有效地抑製同焦平麵上非丈量光點形成的雜散熒光和樣品不同焦平麵發射來的幹擾熒光。這是由於(yu) 光學係統物象共軛，隻有物鏡焦平麵上的點經針孔空間濾波才能形成光點圖像，掃描後可得到信噪比極高的光學斷層圖像，分辨率比普通光學顯微鏡進步1.4倍。LSCM的光源為(wei) 激光，單色性好，基本消色差，成像聚焦後焦深小，縱向分辨率高，可無損傷(shang) 地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強度丈量，不同焦平麵的光學切片經三維重建後能得到樣品的三維立體(ti) 結構，這種功能被形象地稱為(wei) “顯微CT”。
　　
　　LSCM由顯微鏡光學係統，激光光源，掃描裝置和檢測係統構成，整套儀(yi) 器由計算機控製，各部件之間的操縱切換都可在計算機操縱平台界麵中方便靈活地進行。顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guan) 係到係統的成像質量。通常有顛倒和正置兩(liang) 種形式，前者在活細胞檢測等生物醫學應用中使用更廣泛。
　　
　　二.LSCM的生物醫學應用
　　
　　LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數，提供了光學顯微鏡無法顯示的結構，使細胞生物學研究上了一個(ge) 台階。目前我們(men) 可以在亞(ya) 細胞水平進行動態實驗，檢測細胞生物質和離子通道的變化，觀察細胞在生理、病理和藥理情況下對外界因素作用所產(chan) 生的快速反應，進行定性、定量、定時和定位的分析丈量。最常用的功能是細胞三維重建、細胞熒光檢測等。
　　
　　1.細胞的三維重建
　　
　　普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結構為(wei) 多層麵的圖像疊加，結構不夠清楚。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向對細胞進行分層掃描，得到一組光學切片，經A/D轉換後作為(wei) 二維數組貯存。這些數組通過計算機進行不同的三維重建算法，可作單色或雙色圖像處理，組合成細胞真實的三維結構。旋轉不同角度可觀察各側(ce) 麵的表麵形態，也可從(cong) 不同的斷麵觀察細胞內(nei) 部結構，丈量細胞的長寬高、體(ti) 積和斷層麵積等形態學參數。通過模擬熒光處理算法，可以產(chan) 生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體(ti) 感。通過角度旋轉和細胞位置變化可產(chan) 生三維動畫效果。LSCM的三維重建廣泛用於(yu) 各類細胞骨架和形態學分析、染色體(ti) 分析、細胞程序化死亡的觀察、細胞內(nei) 細胞質和細胞器的結構變化的分析和探測等方麵。
　　
　　2.細胞定量熒光測定
　　
　　顯微熒光光度計由於(yu) 顯微鏡和激發光源的限製成像模糊，隻能測定細胞內(nei) 的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為(wei) 光源，對細胞分層掃描，單獨測定，經積分後能得到細胞熒光的正確定量，重複性極佳。它適於(yu) 活細胞的定量分析，可測定細胞內(nei) 溶酶體(ti) 、線粒體(ti) 、DNA含量、RNA含量、酶和結構性蛋白質等物質含量和分布，常用於(yu) 原位分子雜交、腫瘤細胞識別、單個(ge) 活細胞水平的DNA損傷(shang) 及修複的定量分析。它適於(yu) 快速高靈敏度丈量，減少光猝滅的影響，在定量免疫熒光測定方麵應用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達的定量分析，監測腫瘤相關(guan) 抗原表達的定位定量信息，監測藥物對肌體(ti) 免疫功能的作用，監測自身免疫性疾病的多種抗原及藥物對肌體(ti) 免疫功能的作用，監測細胞結合和殺傷(shang) 的形態特征並作定量分析等。細胞定量熒光測定可選用單熒光、雙熒光方式，能自動測定細胞麵積、均勻熒光強度、積分熒光強度及外形因子等多種參數。
　　
　　3.細胞內(nei) 鈣離子pH值和其它離子的動態分析
　　
　　通過一些專(zhuan) 用熒光探針，可對細胞內(nei) 鈣離子、鈉離子及pH值等作熒光標記，並對它們(men) 進行比率值和濃度梯度變化測定。由於(yu) 細胞內(nei) 鈣離子為(wei) 傳(chuan) 遞信息的第二信使，對細胞生長分化起著重要作用，通過單標記或雙標記對細胞內(nei) 鈣離子和其它離子的熒光強度和分布精確測定，測定樣品達到毫秒級的快速變化。借助光學切片功能可以丈量樣品深層的熒光分布以及細胞光學切片的生物化學特性的變化。通過不同時間段的檢測可測定細胞內(nei) 離子的擴散速率，了解它對腫瘤啟動因子、生長因子等刺激的反應。細胞內(nei) 離子丈量廣泛用於(yu) 腫瘤研究、組織胚胎學、細胞生物學和藥理學等領域。
　　
　　4.細胞胞間通訊和膜的活動性
　　
　　動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通訊在細胞增殖和分化中起著重要作用。通過丈量細胞縫隙連接分子的轉移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑製作用及細胞內(nei) 鈣離子、pH值等對縫隙連接作用的影響，並監測環境毒素和藥物在細胞增殖和分化中所起到的作用。選定經熒光染色後的細胞，借助於(yu) 光漂白作用或光損傷(shang) 作用使細胞部分或整體(ti) 不發熒光，實時觀察檢測熒光的恢複過程，可直接反映細胞胞間通訊結果。
　　
　　細胞膜的活動性在進行膜的磷脂酸組成分析，藥物作用點和藥物作用效應，測定溫度反應和物種比較方麵有重要作用。細胞膜熒光探針受到極化光線激發後，發射光極性依靠於(yu) 熒光分子的旋轉，這種有序的運動自由度取決(jue) 於(yu) 熒光分子四周的膜活動性，所以極性丈量能間接反映細胞膜的活動性。
　　
　　綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由於(yu) 其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細胞水平上可作多種功能丈量和分析，成為(wei) 分析細胞學的一項重要研究手段。隨著LSCM設備和應用技術的不斷完善，它在生物醫學和生命科學領域裏將起到更重要的作用。