基於(yu) 其高靈敏度和便攜性，細胞傳(chuan) 感器已成為(wei) 傳(chuan) 統毒物毒性評價(jia) 的一種具有吸引力的評估手段。近年來，許多研究表明三維的細胞培養(yang) 環境可以更好地模擬體(ti) 內(nei) 微環境，從(cong) 而更準確地監測細胞對外源性危害的反應。在三維細胞傳(chuan) 感器的設計上，海藻酸鈉、鼠尾膠原和瓊脂糖等天然水凝膠常常被用以細胞在電極上的固定化。然而，這些水凝膠通常導電性和可塑性較差，且極易從(cong) 電極表麵脫落分離。此外，通過人工來修飾電極也會(hui) 給測試結果帶來很大的個(ge) 體(ti) 誤差。因此，如何提高有效性、穩定性及實現可批量性生產(chan) 仍是生物傳(chuan) 感器研發的一項挑戰。

來自江南大學的孫秀蘭(lan) 教授團隊在“Bioelectrochemistry”上發表的“3D ‘honeycomb’ cell/carbon nanofiber/gelatin methacryloyl (GelMA) modified screen-printed electrode for electrochemical assessment of the combined toxicity of deoxynivalenol family mycotoxins”一文中，研究人員將3D打印技術引入生物傳(chuan) 感器的構建過程，實現了精確、快速、可批量化地生產(chan) 真菌毒素的毒性分析工具的目的。該方法是利用碳納米纖維/明膠甲基丙烯酰基（GelMA）複合導電水凝膠構建了三維細胞培養(yang) 體(ti) 係，通過電化學交流阻抗法測定其阻抗值判斷細胞受毒素刺激後的受損情況，從(cong) 而真實、有效地評價(jia) 真菌毒素細胞毒性。結合聯合指數法（CI）對DON、3-ADON及15-ADON的聯合毒性分析，並判定聯合作用類型。結果表明，該方法操作簡便、可重複性強，顯示了高通量在線檢測分析的潛力，為(wei) 真菌毒素的細胞毒性評估提供了一種新思路。

圖1 細胞電化學傳(chuan) 感器的構建過程及其表征

首先，研究人員利用EFL團隊提供的擠出式生物3D打印機（EFL-BP-6601）和GelMA生物墨水（EFL-GM-60）製備了一種電化學傳(chuan) 感器，並對其實驗條件進行了相關(guan) 的優(you) 化。為(wei) 提高絲(si) 網印刷電極（SPCE）的電化學靈敏度，金納米粒子（AuNP）被電鍍在SPCE的工作電極上，並通過摻入碳納米纖維進一步提高GelMA水凝膠的導電性。打印填充方式的優(you) 化中，“蜂巢”型的打印填充方式顯示出了優(you) 於(yu) 其他填充方式的導電性能。A549細胞/碳納米纖維/GelMA複合水凝膠通過3D打印程序被精確沉積於(yu) 8通道絲(si) 網印刷電極的工作電極上，從(cong) 而得到細胞電化學傳(chuan) 感器。水凝膠為(wei) 細胞提供了類體(ti) 內(nei) 的生長環境並能促進細胞間相互作用。完整細胞膜的存在防止了氧化還原探針進入電極表麵，從(cong) 而增加了電子傳(chuan) 遞阻力。當黴菌毒素刺激細胞時，發生細胞凋亡和死亡。因此，電子轉移加快了工作電極的導電率，根據細胞傳(chuan) 感器的阻抗值便可測得真菌毒素的細胞毒性。

其次，由於(yu) 不同濃度的GelMA水凝膠會(hui) 表現出不同的加工性能和生物相容性特征，研究人員評估了不同濃度的GelMA水凝膠的電導率及其對細胞活力的影響。結果表明，隨著GelMA濃度的增加，絲(si) 網印刷電極的電流值降低（圖2A），可見高濃度的GelMA不利於(yu) 電子傳(chuan) 輸。活/死細胞染色分析（圖2C）可發現，細胞在低濃度（5％-7.5％）的GelMA水凝膠中生長良好，並能觀察到細胞分化過程中的形態變化，細胞聚集成簇（如紅色框所示）。經統計分析（圖2B），A549細胞在5％-7.5％濃度的GelMA水凝膠中的存活率更高，超過93％。

圖2 不同GelMA濃度的電導率和生物相容性的比較

最後，將構建的細胞傳(chuan) 感器暴露於(yu) 不同濃度的DON、3-ADON和15-ADON中，以分析每種黴菌毒素的毒性。構建的電化學毒性評價(jia) 方法表明，真菌毒素降低了A549細胞的活性（圖3）。在三種黴菌毒素中，DON最有效地降低細胞活力，而3-ADON表現出最弱的細胞毒性。三種真菌毒素的半數致死率（IC50）如下：DON 0.9353 μg/ mL、3-ADON12.3194 μg/ mL和15-ADON1.3360 μg/ mL。為(wei) 評估構造的細胞電化學傳(chuan) 感器的準確性，將本方法獲得的結果與(yu) 傳(chuan) 統毒性評價(jia) 方法CCK-8獲得的結果進行了比較，可見兩(liang) 種方法的結果具有良好的一致性。

使用所構建的電化學方法進一步對DON、3-ADON和15-ADON的聯合毒性進行研究。圖4顯示了兩(liang) 種或三種不同濃度比例的DON及其衍生物組合的聯合細胞毒性作用。采用CI聯合指數模型分析了各毒素組合的聯合毒性效應。結果表明，DON +3-ADON、DON +15-ADON和DON +3-ADON + 15-DON的混合物對A549細胞產(chan) 生幾乎完全拮抗的細胞毒性，而3-ADON和15-ADON的組合在低細胞抑製水平上發揮協同作用，而在中高細胞抑製水平則產(chan) 生拮抗作用。

圖3 A549細胞暴露於(yu) DON、3-ADON和15-ADON後的細胞抑製率曲線（以CCK-8法和構建的電化學方法作為(wei) 比較）

圖4 DON、3-ADON和15-ADON聯合作用於(yu) A549細胞後的細胞抑製率曲線（以CCK-8法和構建的電化學方法作為(wei) 比較）

用於(yu) 評估細胞毒性的傳(chuan) 感器適用於(yu) 各種傳(chuan) 感應用，包括毒素檢測和藥物評價(jia) 。利用細胞作為(wei) 生物傳(chuan) 感器元件可以在一定程度上模擬人體(ti) 的生理反應，目前也已經提出了許多用於(yu) 毒性評價(jia) 的生物傳(chuan) 感器的研究。然而大多數細胞傳(chuan) 感器的構建都是基於(yu) 人工操作，不可避免地會(hui) 引入人為(wei) 誤差。本研究開發了一種基於(yu) 生物打印的可用於(yu) 多樣品檢測的電化學傳(chuan) 感器，用於(yu) 評價(jia) DON及其乙酰化衍生物的單一和聯合毒性。本研究表明，DON、3-ADON和15-ADON以劑量依賴性的方式引起細胞活力的顯著降低，本文中的常規毒理指標的檢測結果還發現細胞內(nei) 環境信息係統與(yu) ROS水平、細胞內(nei) Ca2+濃度、凋亡率和壞死率均有關(guan) 係。該方法簡單、有效，為(wei) 可批量化地生產(chan) 毒物的細胞毒性評價(jia) 工具提供新的方向。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2021.107743