顯微成像激光器是什麽(me) ？

飛秒顯微激光器可應用於(yu) 各類先進非線性成像技術，包括多光子激發熒光顯微、諧波產(chan) 生以及拉曼成像。新一代顯微激光光源具備波長可調諧、短脈寬、高重複頻率與(yu) 長期穩定輸出等特性，能夠滿足嚴(yan) 苛的成像需求。

采用 FLINT 飛秒振蕩器采集經 H&E 染色大鼠皮膚的二次諧波（SHG）與(yu) 三次諧波（THG）成像圖。二次諧波信號（綠色）凸顯膠原組織，三次諧波信號（青色）主要呈現蘇木精染色的細胞核。圖像尺寸約 600×600 µm，像素尺寸 0.5 µm/px，像素駐留時間約 14 µs/px，激光功率 20 mW。

圖片由維爾紐斯大學物理學院先進生物醫學光子學課題組提供。

顯微激光器工作原理

多光子顯微依賴可提供高光強的激光源，以此在生物組織內(nei) 部產(chan) 生非線性光學效應。與(yu) 單光子激發不同，多光子激發是兩(liang) 個(ge) 及以上低能量光子同時被熒光分子吸收，進而完成激發。該過程需要高光子數密度，將飛秒脈衝(chong) 緊密聚焦即可高效實現。

由此，熒光激發幾乎僅(jin) 發生在顯微物鏡焦點處，無需共聚焦針孔即可實現天然光學層析效果。這種局域化激發能大幅降低離焦熒光信號，減少成像平麵外的光漂白與(yu) 光損傷(shang) 。

顯微成像常用激光器類型

不同顯微成像場景，需搭配適配成像條件、熒光探針及穿透深度的專(zhuan) 用激光器。

雙光子顯微激光器

雙光子顯微激光器通常兼具高重複頻率、飛秒脈衝(chong) 與(yu) 近紅外波段波長可調諧三大特點。數十 MHz 的重複頻率可在快速掃描時高效生成熒光信號，約 100 fs 的脈衝(chong) 能產(chan) 生非線性激發所需的峰值光強。調諧輸出覆蓋 700–1300 nm 波段，可激發神經成像、功能成像、發育生物學中廣泛使用的各類熒光蛋白、鈣指示劑及其他熒光探針。

采用搭載紅外光參量放大器（I-OPA）的 CARBIDE 飛秒激光器，對成年小鼠心房開展雙光子光片成像。

本圖由 Bliq Photonics 公司提供。

三光子顯微激光器

相較於(yu) 雙光子係統，三光子顯微激光器單脈衝(chong) 能量更高，以實現高效高階非線性激發。常用激發波長 1300 nm、1700 nm 恰好對應生物組織透明窗口，組織散射損耗更低，可在高散射生物樣本中實現更深層成像。三光子激發的空間約束效果更強，能抑製離焦背景熒光，在近 1 mm 甚至更深的成像深度下仍保持良好圖像對比度。為(wei) 獲得充足成像信號，三光子成像普遍采用約 50 fs 脈衝(chong) 、μJ 級單脈衝(chong) 能量、MHz 級重複頻率的激光光源。

采用 CRONUS-3P 激光器，在 1300 nm 激發波長下對活體(ti) 斑馬魚進行多模態三維成像。

三光子熒光（3PEF）—— 綠色；透射式二次諧波（trans SHG）—— 黃色；

反射式三次諧波（epi THG）—— 深藍色；透射式三次諧波（trans THG）—— 青色。

圖像由日內(nei) 瓦大學 Luigi Bonacina 課題組提供。

可調諧飛秒激光器

顯微專(zhuan) 用可調諧激光器為(wei) 現代多光子成像提供波長適配自由度。通過將激發波長與(yu) 熒光蛋白、鈣指示劑及光敏感蛋白的吸收特性相匹配，可調諧激光光源可提升激發效率，同時減少樣品中不必要的能量沉積。波長可調特性同時兼容多種多模態成像手段：二次 / 三次諧波成像（SHG/THG）、相幹 anti-Stokes 拉曼散射（CARS）、受激拉曼散射（SRS）。

采用 CRONUS-2P 設備采集流動聚苯乙烯（PS）與(yu) 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球的 CARS 圖像。下方係列圖像為(wei) 選定區域的時序成像，采樣間隔 1 秒，用以直觀展示微球流動過程；白色虛線作為(wei) 運動參照基準。

DOI: 10.1002/jrs.6671

高重複頻率激光器

高重複頻率顯微激光器多用於(yu) 高速掃描、信號穩定輸出的實驗場景。重複頻率從(cong) 幾 MHz 至數十 MHz，單次成像周期內(nei) 可完成大量激發過程，熒光生成效率更高，信噪比更優(you) 。

顯微激光器應用領域

顯微激光光源廣泛用於(yu) 各類生命科學與(yu) 生物醫學研究：功能性神經成像、光遺傳(chuan) 學、發育生物學、深層組織成像。依托多光子熒光顯微、拉曼顯微、諧波生成等先進成像技術，可在高空間分辨率、具備光學層析能力的前提下，獲取生物樣品的結構、功能與(yu) 化學組分信息。

利用 PHAROS 飛秒激光器對小鼠嗅球神經元開展全息雙光子光遺傳(chuan) 刺激。

圖像由紐約大學 Shy Shoham 課題組與(yu) Dmitry Rinberg 課題組提供。

DOI: 10.1016/j.neuron.2020.07.034

飛秒激光器用於(yu) 顯微成像的優(you) 勢

采用飛秒脈衝(chong) 可在更低平均功率下高效產(chan) 生信號，而長脈衝(chong) 則需要更高的平均功率才能實現同等效果。這一點對生物樣品至關(guan) 重要：過高平均功率會(hui) 造成組織升溫，引發光損傷(shang) 。深層成像場景下，脈寬的影響更為(wei) 關(guan) 鍵 —— 高階非線性效應高度依賴峰值光強。以三光子顯微為(wei) 例，通常需要約 50 fs 脈衝(chong) ，才能在深層組織中達到理想激發效率。

脈衝(chong) 間能量穩定性同樣關(guan) 鍵。多光子顯微中，脈衝(chong) 能量波動會(hui) 直接改變熒光信號強度，在圖像中形成噪點或明暗不均。因此高能量穩定性是定量檢測、長時間成像、高速采集實驗的必備條件。

此外，新一代顯微飛秒激光器支持波長調諧，可針對不同熒光蛋白、基因編碼指示劑、光敏感蛋白優(you) 化激發條件。可調激發光適配多種非線性成像模式，研究者可根據目標成像深度、生物透明窗口靈活選擇最優(you) 波長。

高端機型還可實現激發脈衝(chong) 時序精準調控。顯微光學元件會(hui) 對脈衝(chong) 引入群速度色散（GDD），先進激光係統內(nei) 置色散補償(chang) 模塊，保證到達樣品處的脈衝(chong) 維持最短脈寬，保障峰值光強。

搭載自適應光學的三光子顯微鏡可實現焦點探測與(yu) 光束整形，同步校正像差與(yu) 光散射帶來的成像畸變。采用 ORPHEUS-F 激光器 1300 nm 波長激發，可在完整腦組織中穿透軟腦膜下最深 1.1 mm 處完成成像。

圖像由香港科技大學 Jianan Y. Qu 課題組提供。

雙光子顯微與(yu) 三光子顯微的區別

雙光子、三光子顯微均屬於(yu) 非線性成像，依靠多光子同步吸收產(chan) 生熒光；二者雖都可實現光學層析與(yu) 深層組織成像，但在激發波長、激光參數、成像深度上存在明顯差異。

雙光子顯微常用 700–1300 nm 激發光，搭配數十 MHz 高重頻飛秒激光器。該技術可高效激發絕大多數熒光探針，掃描速度快，在生物組織中成像深度可達數百 mm。但隨著成像深度增加，沿光路產(chan) 生的離焦熒光會(hui) 持續降低圖像對比度，最終限製最大穿透深度。

三光子顯微采用更長波長（主流 1300 nm、1700 nm），對應組織散射更低的生物透明窗口。三光子屬於(yu) 更高階非線性效應，熒光信號僅(jin) 高度集中在焦點體(ti) 積內(nei) ，可大幅壓製焦平麵外背景噪聲。因此在雙光子成像對比度嚴(yan) 重衰減的深層區域，三光子仍能維持清晰成像。

高效三光子激發一般需要約 50 fs 脈衝(chong) 、更高單脈衝(chong) 能量、MHz 級重複頻率。該參數組合既能為(wei) 深層成像提供充足峰值光強，又能將平均功率控製在生物樣本可耐受範圍內(nei) 。

目前三光子顯微已成為(wei) 深層神經成像等領域的主流方案，適用於(yu) 需在高散射組織中實現 1 mm 及以上深度觀測的實驗。

在 Thorlabs Bergamo II 型顯微鏡上，分別采用常規雙光子激光器（920 nm）與(yu) CRONUS-3P 三光子激光器（1300 nm），對小鼠視覺皮層表達 GCaMP 探針的神經元開展在體(ti) 雙光子、三光子鈣成像對比實驗。

圖片由 CSHL ISFNS 2024 組委會(hui) 、Willis Broden Jr. 以及 Sergey Matveev（Thorlabs）提供。